Cuantificación de ácidos nucleicos en espectrofotómetros
La cuantificación de ácidos nucleicos es la función más frecuentemente utilizada de un espectrofotómetro. Los oligonucleótidos, el ADN bicatenario monocatenario y el ARN se pueden cuantificar en tampones. El pico de absorción del pico de absorción más alto del ácido nucleico es 260 nm. Cada ácido nucleico tiene una composición molecular diferente y, por lo tanto, tiene diferentes factores de conversión. Para cuantificar diferentes tipos de ácidos nucleicos, seleccione los coeficientes correspondientes de antemano. Por ejemplo, la absorbancia de 1OD es equivalente a 50 μg / ml de dsDNA, 37 μg / ml de ssDNA, 40 μg / ml de RNA y 30 μg / ml de Olig, respectivamente. El valor de absorbancia después de la prueba se convierte por el coeficiente anterior para obtener la concentración de muestra correspondiente. Antes de realizar la prueba, seleccione el procedimiento correcto, ingrese los volúmenes de la solución madre y el diluyente, y pruebe las soluciones en blanco y de muestra. Sin embargo, el experimento no fue fácil. Las lecturas inestables pueden ser el mayor dolor de cabeza para los experimentadores. Cuanto mayor es la sensibilidad del instrumento, mayor es la deriva de la absorbancia exhibida.
De hecho, el principio de diseño y el principio de funcionamiento del espectrofotómetro permiten que el valor de absorbancia cambie dentro de un cierto rango, es decir, el instrumento tiene un cierto grado de precisión y precisión. Tal como la precisión del Biophotometer de Eppendorf ≤ 1.0% (1A). Los resultados de estas pruebas múltiples varían entre la media del 1.0% y son todos normales. Además, las propiedades fisicoquímicas del ácido nucleico, el pH del tampón para disolver el ácido nucleico, la concentración de iones, etc. también deben tenerse en cuenta: durante la prueba, una concentración de iones demasiado alta también causará la lectura de deriva como TE, lo que estabilizará en gran medida la lectura. La concentración diluida de la muestra también es un factor no despreciable: debido a la presencia inevitable de pequeñas partículas en la muestra, especialmente muestras de ácido nucleico. La presencia de estas pequeñas partículas interfiere con el efecto de prueba. Para minimizar la influencia de las partículas en los resultados de la prueba, se requiere que la absorbancia del ácido nucleico sea al menos 0.1 A, y la absorbancia sea preferiblemente 0.1-1.5 A. En este rango, no debe haber burbujas en el mezcla, y no hay suspensión en el espacio en blanco. De lo contrario, las lecturas flotan violentamente; la misma taza colorimétrica se debe usar para probar el blanco y la muestra; de lo contrario, la diferencia de concentración es demasiado grande; el coeficiente de conversión y la unidad de concentración de muestra son iguales; La cubeta usada por la ventana; el volumen de la muestra debe alcanzar más del volumen mínimo requerido de la copa de color, etc.
Además de la concentración de ácido nucleico, el espectrofotómetro muestra varias relaciones muy importantes simultáneamente para indicar la pureza de la muestra, como la relación A260 / A280, con el fin de evaluar la pureza de la muestra, ya que el pico de absorción de la proteína es 280 nm. Las muestras puras tienen una proporción mayor a 1.8 (ADN) o 2.0 (ARN). Si la proporción es inferior a 1.8 o 2.0, indica la presencia de proteínas o sustancias fenólicas. A230 indica que hay algunos contaminantes en la muestra, tales como carbohidratos, péptidos, fenoles, etc. La relación de ácido nucleico puro A260 / A230 es mayor que 2,0. A320 detecta la turbidez de la solución y otros factores de interferencia. Muestra pura, A320 generalmente es 0.
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