Cuantificación espectrofotométrica de proteína colorimétrica
Las proteínas son generalmente una mezcla de proteínas. Los ensayos colorimétricos se basan en constituyentes de proteínas: los aminoácidos (p. Ej., Tirosina, serina) reaccionan con un grupo o colorante cromogénico adicional para producir un material coloreado. La concentración del material coloreado está directamente relacionada con la cantidad de aminoácidos que reacciona la proteína, lo que refleja la concentración de proteína.
Método colorimétrico
Existen varios métodos, como BCA, Bradford y Lowry.
El método Lowry: basado en la reacción más temprana de Biuret y mejorado. La proteína reacciona con Cu2 para producir una reacción azul. Sin embargo, el método Lowry es más sensible que Biuret. La desventaja es la necesidad de agregar secuencialmente varios reactivos diferentes; la reacción lleva mucho tiempo; es susceptible a sustancias no proteicas; las proteínas que contienen EDTA, Triton x-100 y sulfato de amoníaco no son adecuadas para este método.
Análisis de ácido Bicinchoniinine: este es un ensayo de proteína más nuevo y más sensible. La proteína a analizar reacciona con Cu2 en una solución alcalina para producir Cu, que forma un quelato con BCA para formar un compuesto púrpura con un pico de absorción a 562 nm. La relación lineal entre la concentración de este compuesto y la proteína es fuerte, y el compuesto formado después de la reacción es muy estable. En relación con el método Lowry, la operación es simple y la sensibilidad es alta. Sin embargo, similar al método de Lowry, es susceptible a la interferencia con proteínas y detergentes.
El método de Bradford: el principio de este método es que la proteína reacciona con Coomassie Brilliant Blue para producir un compuesto coloreado que se absorbe a 595 nm. Su mayor característica es su sensibilidad, que es 2 veces la de Lowry y BCA. Es más simple y más rápido. Solo requiere un tipo de reactivo de reacción. El compuesto puede ser estable durante 1 hora para facilitar el resultado; Al interferir con Lowry, BCA reacciona con agentes reductores (por ejemplo, DTT, mercaptoetanol) compatibles. Sin embargo, todavía es sensible a los detergentes. El principal inconveniente es que diferentes estándares pueden conducir a grandes diferencias en los resultados de la misma muestra y no a resultados comparables.
Algunos investigadores que están expuestos a medidas colorimétricas por primera vez pueden confundirse con los resultados de las diversas pruebas colorimétricas. ¿Qué tipo de métodos crees que se confunden? Debido al hecho de que los grupos reaccionaron de diferentes maneras y los grupos cromogénicos no son los mismos, se usan varios métodos simultáneamente para hacer inconsistentes las concentraciones de muestra de la misma muestra. Por ejemplo, Keller et al. probaron la proteína en leche humana y encontraron que las concentraciones medidas por Lowry y BCA eran significativamente más altas que las de Bradford. La diferencia fue significativa. Incluso si se determina la misma muestra, la muestra estándar seleccionada por el mismo método colorimétrico es inconsistente, y la concentración después de la prueba también es inconsistente. Por ejemplo, use Lowry para analizar la proteína en el homogenado de células, usando BSA como estándar, con una concentración de 1.34 mg / ml, y una globulina como estándar con una concentración de 2.64 mg / ml. Por lo tanto, antes de seleccionar un método colorimétrico, es preferible referirse a la composición química de la muestra a analizar y encontrar una proteína estándar químicamente similar como estándar. Además, el método colorimétrico para cuantificar proteínas a menudo causa problemas ya que el valor de absorbancia de la muestra es demasiado bajo, lo que resulta en una gran diferencia entre la concentración de muestra medida y la concentración real. La cuestión clave es que el color de la parte importante del espectrofotómetro 1011, la cubeta, tiene una vida media determinada, por lo que cada método colorimétrico indica el tiempo de la prueba de reacción. Todas las muestras (incluidas las muestras estándar) se deben probar dentro de este tiempo. Si el tiempo es demasiado largo, el valor de absorbancia obtenido se reduce y el valor de concentración convertido disminuye. Además, la temperatura de reacción, el valor de pH de la solución, etc. son todos factores importantes que afectan el experimento. Además, es muy importante usar colorimetría de plástico. Evite usar cubetas hechas de cuarzo o vidrio porque el color después de la reacción causará que el cuarzo o el vidrio se coloreen, lo que da como resultado una absorbancia inexacta de la muestra.
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