Introducción al principio y aplicación de componentes generales del espectrofotómetro

El espectrofotómetro es ampliamente utilizado en investigaciones biológicas, químicas, clínicas y ambientales.
La espectrofotometría mide cuánta luz puede absorber un químico al pasar un haz de luz a través de una muestra en un espectrofotómetro.
Al medir la intensidad de luz detectada, el método puede usarse para determinar la concentración de soluto en la muestra.
El concepto de espectrofotometría.
El haz enviado a la muestra consiste en un haz de fotones.
Cuando los fotones se encuentran con las moléculas en la muestra, las moléculas pueden absorber algunas de ellas, reducir la cantidad de fotones en el haz y reducir la intensidad de la señal de detección.
La transmitancia es parte de la luz que pasa a través de la muestra. Se define como la intensidad de la luz que pasa a través de la muestra a la intensidad de la luz incidente.
La absorbancia es opuesta a la transmitancia, correspondiente a la cantidad medida por el espectrofotómetro.
Según la absorbancia, la concentración de la muestra de solución puede determinarse a partir de la ley de Bill Lambert, que muestra que existe una relación lineal entre la absorbancia y la concentración de la muestra. Según la ley de Lambert de la cerveza, la absorbancia es el producto del coeficiente de absorción, que es una medida de la cantidad de luz absorbida por el soluto a una longitud de onda dada y la distancia a través de la cual pasa la luz. Muestra, o distancia de viaje, y concentración de soluto. En general, el objetivo de medir la absorbancia es medir la concentración de la muestra.
Componentes del espectrofotómetro
Cada espectrofotómetro consta de una fuente de luz, un colimador (lente o dispositivo de enfoque para transmitir haces fuertes y rectos), un monocromador para separar haces de diferentes longitudes de onda y un selector de longitud para seleccionar la onda o el surco de la longitud de onda deseada. La longitud de onda de la luz utilizada en el espectrofotómetro presentado en este video está en el rango de luz ultravioleta y visible. El espectrofotómetro también incluye un soporte de muestra, un fotodetector y una pantalla que muestra los resultados del detector.
El espectrofotómetro más reciente está directamente acoplado a una computadora, donde se pueden controlar los parámetros experimentales y mostrar los resultados.
Principio de funcionamiento del espectrofotómetro.
Al realizar la espectrofotometría, es importante tomar las precauciones adecuadas, como usar guantes, según el tipo de solución biológica o química que utilice.
Encienda el dispositivo y permita que la lámpara y la electrónica se calienten antes de medir el espectro UV-Vis de la muestra.
Prepare una muestra en blanco de la misma solución con el mismo pH y una fuerza iónica similar, pero sin los componentes a analizar; Como la cubeta y el disolvente pueden dispersar la luz, es necesario analizar la muestra.
El soporte de muestra de espectrofotómetro tradicional está diseñado para sostener cuencos de plástico y cuarzo. Pipetee la solución original en un recipiente.
Después de limpiar las huellas digitales y salpicarlas en el exterior del recipiente, inserte la cubeta correctamente en el soporte de la muestra y cierre la puerta de la tapa.
Nunca olvide cerrar la puerta porque la radiación UV de un espectrofotómetro abierto puede dañar sus ojos y su piel.
Programe la longitud de onda deseada o el rango de longitud de onda que se transmitirá a la muestra. Esto depende de la mejor longitud de onda que pueda absorber el componente que se analiza. Luego, la máquina se pone a cero midiendo la muestra en blanco, que resta la absorbancia del fondo debido al tampón de muestra.
Dependiendo del tipo de experimento de espectrofotometría que esté realizando, puede ser necesario generar una curva estándar antes de la medición de la muestra, a partir de la cual se puede determinar la concentración del compuesto analizado en la muestra.
Permita que la muestra alcance la temperatura adecuada y mezcle suavemente para evitar la introducción de burbujas. La muestra se puede agregar directamente al recipiente dentro de la máquina y se puede hacer una lectura.
Después de medir la absorbancia de la muestra, el experimento se calcula correctamente; por ejemplo, para determinar la concentración o el nivel de actividad enzimática.
Aplicación de espectrofotómetro
Uno de los usos comunes del espectrofotómetro es medir la densidad celular. La medición de la densidad celular se puede utilizar para producir la curva de crecimiento logarítmico de las bacterias, a partir de la cual se puede determinar el momento óptimo para la integración de la proteína recombinante.
El espectrofotómetro también se puede usar para medir la velocidad de reacción química. En esta realización, la absorbancia se usa para controlar la reacción enzimática, que desaparece con el tiempo a través de una reacción intermedia de 452 nm. La tasa de este paso enzimático se puede calcular haciendo coincidir los datos con la ecuación apropiada.
La introducción del micro espectrofotómetro elimina la necesidad del soporte de muestra. Estos espectrofotómetros usan tensión superficial para mantener la muestra.
El microspectrofotómetro es la mejor opción para medir la masa y la concentración de muestras pequeñas y caras, como las biomoléculas, incluidas las proteínas y los ácidos nucleicos.
La absorbancia de proteínas a 280 nm depende del contenido de cadenas laterales aromáticas que se encuentran en triptófano, tirosina y fenilalanina, así como el enlace disulfuro entre las dos cisteínas.
La concentración de proteína se puede determinar por su absorbancia a 280 nm y su coeficiente de absorción, que se basa en la composición de aminoácidos.
El ADN y el ARN tienen la absorbancia máxima a 260 nm, a partir de la cual se pueden determinar sus concentraciones. La pureza de los ácidos nucleicos también se puede evaluar a partir de la relación de lecturas de absorbancia a longitudes de onda específicas.